Комплексни имунодиагностични реакции. Реакция на свързване на комплемента (CFR)

(RSK), предложен от Дж. Бордеи около. Джангу. Реакцията включва две фази (фиг. 10-18).

Във фаза I (специфична) реакция на свързване на комплемента (CFR)желаният Ag (или AT) реагира с диагностичен антисерум (или Ag diagnosticum) и комплемент. Полученият комплекс Ag-AT свързва комплемента.

Във фаза II (индикатор) реакция на свързване на комплемента (CFR)Наличието на свободен комплемент се определя чрез въвеждане в реакционната среда на хемолитичната система - овчи еритроцити и хемолитичен серум, съдържащ AT към тях. Ако Ag и AT не съвпадат един с друг и не образуват имунни комплекси, тогава не се осъществява свързване на комплемента. В това. В този случай свободният комплемент взаимодейства с компонентите на хемолитичната система, фиксирайки еритроцит-антиеритроцитния AT комплекс. Последицата от това е хемолиза на индикаторни клетки (феноменът на „лакирана кръв“) - реакцията се счита за отрицателна.

Ако във фаза I реакцията на свързване на комплемента (CFR) AT и Ag съответстват един на друг, тогава получените имунни комплекси свързват комплемента, разрушаването на еритроцитите след добавянето на хемолитичната система не се наблюдава и реакцията се счита за положителна. Основните недостатъци на RSC: сложност (включва 5 компонента), лабилност на някои компоненти [те трябва да бъдат приготвени непосредствено преди реакцията (комплемент) или няколко дни предварително (овчи червени кръвни клетки)] и възможни антикомплементарни свойства в серума и Ag. Въпреки това RSC се използва при диагностицирането на много заболявания, например при диагностицирането на сифилис (реакция на Васерман).

Реакция на свързване на комплемента (CFR)

RSK се извършва с участието не само на AG и AT, но и на комплемент. Тъй като не е придружено от видими промени, се използва хемолитична индикаторна система за откриване на фиксация на комплемента. Тази система се състои от овчи еритроцити и заешки хемолитичен серум. В присъствието на комплемент в хемолитичния серум настъпва добре наблюдаван лизис на червени кръвни клетки. Принципът на метода е, че ако в експеримента се образува комплекс AG-AT и комплементът се свърже с него (т.е. в разтвора не е останал свободен комплемент), тогава няма да настъпи лизис на червените кръвни клетки и червеният кръвните клетки ще се утаят на дъното на епруветката. Ако комплексът не се образува, комплементът остава свободен и реагира с хемолитичната система, което води до лизиране на червени кръвни клетки. Този механизъм е в основата на реакцията на Васерман (диагностика на сифилис). Общата активност на системата на комплемента се определя в така наречената хемолитична система чрез RSC. Хемолитичната система е смес от овчи еритроцити и стандартен специфичен антисерум, съдържащ антитела към тези еритроцити, но изкуствено лишен от собствения си комплемент. В такава система хемолизата на еритроцитите не възниква поради липсата на важна връзка в процеса на свързване на AT с AG - комплемент, унищожен чрез предварително нагряване. Ако към такава система се добави серум на пациента, съдържащ комплемент, се образува имунен комплекс и червените кръвни клетки се слепват и хемолизират. Колкото по-висока е концентрацията на комплемента в тестовия серум, толкова по-изразена е хемолизата на еритроцитите.

Нормалните нива на серумния комплемент са 20-40 хемолитични единици. При остри инфекциозни и възпалителни заболявания, като правило, има повишаване на активността на комплемента, при хронични заболявания тя намалява. Ниските стойности на хемолитичната активност могат да отразяват вроден или придобит дефицит на отделни компоненти на системата на комплемента. Трябва да се отбележи, че дефектите в тази система се считат за най-често срещаните наследствени аномалии на човешките протеини. Те могат да играят патогенетична роля при заболявания и синдроми като:

• рецидивиращи бактериални пиогенни инфекции на дихателната система, кожата и други органи: пневмония, бронхиектазии, рецидивиращ синузит, пиодермия, генерализирани бактериални инфекции, септицемия;
• повтарящи се менингококови и гонококови инфекции (менингококов менингит, дисеминирани гонококови инфекции, гонококов артрит и др.);
• автоимунни, алергични заболявания и заболявания на имунните комплекси: системен лупус еритематозус, дерматомиозит, мембранопролиферативен гломерулонефрит, болест на Schönlein-Henoch, синдром на Sjogren, тромбоцитопенична пурпура, склеродермия, ювенилен ревматоиден артрит, рецидивиращ ангиоедем (особено често - ларингоспазъм), дерматози, фоточувствителност и др .

Реакцията на фиксиране на комплемента се използва за лабораторна диагностика на рикетсиални инфекции, вирусни инфекции (грип, морбили, кърлежов енцефалит и др.) И се основава на способността на комплемента да се свързва с AG-AT комплекса. Комплементът се адсорбира върху ЕС фрагмента на имуноглобулини О и М. Реакцията протича в две фази. Първата фаза е взаимодействието на АГ и АТ. Тестовият серум се използва като материал, съдържащ антитела, към който се добавя известен антиген. Към тази система се добавя стандартен комплемент и се инкубира при 37 °C за 1 час.Втората фаза е да се идентифицират резултатите от реакцията с помощта на индикаторна хемолитична система (овчи червени кръвни клетки и заешки хемолитичен серум, съдържащ хемолизини към овчи червени кръвни клетки) . Индикаторна система се добавя към сместа AG-AT-комплемент (фаза 1) и отново се инкубира при 37 °C за 30-60 минути, след което се оценяват резултатите от реакцията. Разрушаването на червените кръвни клетки възниква, когато те се присъединят към системата на хемолитичния комплемент. Ако комплементът преди това е бил адсорбиран върху комплекса AG-AT, тогава хемолизата на еритроцитите не настъпва. Хемолиза възниква, когато тестовият серум съдържа специфични антитела за диагностична хипертония. При липса на специфични антитела в тестовия серум, комплексът антиген-ab не се образува и комплементът остава несвързан. Когато се добави хемолитична система, комплементът се прикрепя към нея и настъпва хемолиза на червените кръвни клетки. Интензитетът на RSC се оценява с помощта на четири кръстосана система в зависимост от степента на забавяне на хемолизата и наличието на утайка от червени кръвни клетки. Всички компоненти на RSC, с изключение на тестовия серум, трябва да бъдат титрувани (фиг. 10.9).

Ориз. 10.9.А- лизис на сенсибилизирани еритроцити в присъствието на комплемент: b - липса на хемолиза поради фиксиране на комплемента от комплекса AG-AT; V- лизис на еритроцити в резултат на отсъствието на AG-AT комплекса

Реакция на фиксиране на комплемента(RSC) е сложна двустепенна серологична реакция. Той използва пет съставки, които изграждат две системи: антиген, антитяло, комплемент (първа система); овчи еритроцити, сенсибилизирани (третирани) с хемолитичен серум, съдържащ антитела, специфични за тях (втора или индикаторна хем система). В този случай взаимодействието на антитялото с антигена на първия етап от реакцията води до образуването на имунен комплекс, който адсорбира комплемента, но това не може да се открие визуално. На втория етап хемовата система се използва като индикатор за фиксиране на комплемента върху комплекса антиген-антитяло, който, като имунен комплекс, също е способен да го адсорбира. В крайна сметка има два възможни изхода от реакцията. Ако антитялото и антигенът съответстват едно на друго и комплементът се адсорбира от получения комплекс, няма да настъпи лизиране на еритроцитите на хемовата система. Ако антитялото не съвпада с антигена и обратно, комплементът, оставайки свободен, ще се присъедини към хемовата система и ще причини хемолиза.

Подобно на други серологични тестове, RSA може да се използва за откриване на специфични антитела от известен антиген или за откриване на антиген от известни антитела.

Обща характеристика на съставките на RSC.

1. Преди провеждане на реакцията, тестваният СЕРУМ се загрява на водна баня в продължение на 30 минути, за да се инактивира собствения му комплемент и се разрежда, като се започне от 1:5.

2. АНТИГЕН могат да бъдат бактериални култури, техни лизати, вируси и вирусосъдържащи материали, екстракти от патологично променени органи и тъканни липиди.

3. ДОПЪЛНЕНИЕ – серум от морско свинче, получен в деня на опита. Понастоящем се използва промишлен сух комплемент.

4. ХЕМОЛИТИЧНА СИСТЕМА се състои от хемолитичен серум и 3% суспензия от овчи червени кръвни клетки, смесени в равни обеми. За сенсибилизиране на еритроцитите с хемолизини сместа се държи в термостат при температура 37 ° С в продължение на 30 минути.

Настройка на основния експеримент на RSC.СЕРУМ, АНТИГЕН И КОМПЛЕМЕНТ се добавят към 1 епруветка, серум, комплемент и вместо антиген изотоничен разтвор на натриев хлорид (SERUM CONTROL) се добавят към втората епруветка, антиген, комплемент и същият разтвор на натриев хлорид се добавят към третата епруветка ( АНТИГЕН КОНТРОЛ). Епруветките се поставят в термостат при температура 37°С за 1 час. В същото време се приготвя хемолитична система, която след това се добавя към трите епруветки след отстраняване на стойката от термостата. След смесване на скъпоценната система със съставките на три епруветки, последните отново се поставят в термостат за 1 час и след това време се вземат предвид резултатите от RSK.

Когато се вземе предвид RSC, интензивността на реакцията се обозначава с плюсове: "++++" - рязко положителна реакция с пълно забавяне на хемолизата, течността в епруветката е безцветна, всички червени кръвни клетки са се утаили до дъното; “+++”, “++” – положителна реакция, характеризираща се с увеличаване на цвета на течността поради хемолиза и намаляване на броя на червените кръвни клетки в утайката; “+” – слабо положителна реакция, течността е интензивно оцветена, на дъното на епруветката има малко количество червени кръвни клетки. Отрицателната реакция се обозначава със знак „–“, при който се наблюдава пълна хемолиза, течността в епруветката има интензивен розов цвят („лакова кръв“).

RSC е много сложна, но много чувствителна специфична реакция. Широко използван при диагностицирането на сифилис, хронична гонорея, магарешка кашлица, актиномикоза, всички рикетсиози и вирусни инфекции.

Свързан имуносорбентен анализ.

Методът е разработен в началото на 70-те години независимо един от друг от три групи учени. Методът наподобява RIA, но се основава на маркиране на Ag или Ab, които влизат в реакцията с ензим. Движението на етикета със субстрата обикновено е придружено от промяна в цвета на средата. Понастоящем са създадени множество модификации на този метод, но най-широко използваният е хетерогенният твърдофазов ELISA (твърдофазен). Има:

1) ДИРЕКТЕН ELISA в ТВЪРДА ФАЗА. В такъв случай:

1. Серумът с Ab се инкубира с Ag, фиксиран върху твърда подложка (най-често това е пластмасова микроплака).

2. Abs, които не са свързали Ag, се отстраняват чрез многократно измиване.

3. Белязаният с ензим серум се добавя към Abs, които са свързали Ag.

4. Определете броя на маркерните ензими, свързани с At.

2) КОНКУРЕНТЕН ТВЪРДОФАЗЕН ELISA.

1. Добавете суроватка. Ако съдържа специфични Abs, тогава те се свързват с Ags, фиксирани върху твърд субстрат. Ако няма специфични Abs, тогава Ag изглежда несвързан.

2. При добавяне на антитела, специфични за фиксиран Ag, в първия случай те няма да имат с какво да взаимодействат (повечето Ag вече са свързани) Þ съдържанието на маркера е ниско. Във втория случай специфични Abs ще се свържат с Ag и по време на измиване те няма да бъдат отмити Þ високо съдържание на маркер.

Подобно на m.b. АНТИТЕЛАТА са фиксирани, а различни фирми произвеждат таблетки с вече фиксирани антитела.

В сравнение с класическите методи за откриване на Ag, този метод ви позволява директно да записвате тяхното взаимодействие с Ab, а не вторични прояви (аглутинация, утаяване или хемолиза). Методът е много ЧУВСТВИТЕЛЕН (достатъчна е концентрация от 1 ng/ml).

Определяне: Хламидия, клостридия, ХИВ и др.

8. Реакция на фагоцитоза.

Фагоцитозата се осъществява от микрофаги и макрофаги. Етапи на фагоцитоза: подход, адхезия, потапяне, смилане.

Оценка на функционалната активност на фагоцитните клетки.

Количество Фагоцитната активност на гранулоцитите и моноцитите се оценява в цяла кръв, в левкоцитна суспензия или в обогатени фракции от фагоцитни клетки. Като стандартни обекти на фагоцитоза се използват монодисперсни латексни частици с диаметър 1,0-2,0 микрона, суспензия от топлинно убити бактерии или дрождеподобни гъбички.

Фагоцитите се смесват с фагоцитиран материал в съотношение 1:10 или 1:100 и се инкубират при 37°С в продължение на 30 минути при постоянно разбъркване. След това епруветките се центрофугират и утайката се ресуспендира в капка кръвен серум, за да се подготви цитонамазка. В петна, фиксирани с оцветяване на May-Chrunwald и оцветени по Romanovsky-Giemsa, се изчисляват процентът на фагоцитните клетки (FP - фагоцитен индикатор) и броят на абсорбираните частици на 1 клетка (PF - фагоцитен брой).

При здрав човек FP = 40-80%, FC = 1-5.

9. Диагностикуми.

Диагностикумите са суспензия от определени микробни клетки, убити чрез топлина или формалин с известно клетъчно съдържание на единица обем. Като антиген могат да се използват и суспензии от живи бактерии. Феноменът на реакцията се появява предварително след два часа (при 37 0 С), крайният резултат се взема предвид при стайна температура след 18-20 часа. За диагностика положителната реакция представлява интерес само при определен серумен титър, който служи за диагностика. Така за бруцелоза диагностичният титър е 1:200, а за туларемия -1:100. За да откриете антитела, можете да извършите експресни тестове за аглутинация (времето за отчитане е няколко минути). Например: 1. Кръвно-капкова реакция при туларемия. Капка дестилирана вода (за хемолиза) и капка tularemia diagnosticum се нанасят върху капка от цялата кръв на пациента върху специално стъкло. Реакцията настъпва в рамките на 1-2 минути, аглутинатите са ясно видими под формата на белезникави бучки. 2. Провежда се експресна реакция на аглутинация на Хеделсон върху стъкло за бруцелоза.

Тези реакции не позволяват определяне на количеството антитела в серума б) за идентифициране на чиста култура на патогени на инфекциозни заболявания. За тази цел се използват имунни диагностични тестове.

аглутиниращи серуми, произведени от институти за ваксини и серуми чрез имунизиране на животни с цели микробни клетки. За да се гарантира автентичността на серума, е по-добре да се използват адсорбирани, така че да съдържат само антитела, съответстващи на определен вид или тип микроорганизъм.

Принципи за получаване на имунни серуми.

Имунният серум (антисерум) е кръвен серум, съдържащ антитела към даден антиген. В повечето случаи имунни (диагностични) серуми към микробни, тъканни и други антигени се получават експериментално чрез имунизиране на животни със съответните антигени.

Сред основните изисквания към антисерумите са тяхната висока специфичност и достатъчно съдържание на антитела. Въз основа на специфичността антисерумите се разграничават между поливалентни (полиспецифични) и моновалентни (моноспецифични) антисеруми. Поливалентните серуми съдържат антитела към много антигени, моноспецифични - към един специфичен антиген. Можете да получите моноспецифични серуми:

1) използване на високо пречистени антигени за имунизиране на животни,

2) пречистване на естествени серуми от антитела с нежелана специфичност.

За тази употреба:

1) имуноафинитетен метод, който се основава на свързването на антитела с определена специфичност със съответните антигени, имобилизирани върху твърдофазен носител, последвано от разделяне на получените антиген-АВ комплекси и изолиране на антитела;

2) Адсорбционен метод на Кастелани. За тази цел микроорганизми, съдържащи всички групови антигени, се добавят последователно към нативния имунен серум, съдържащ групово-специфични кръстосано реагиращи антитела, като по този начин се адсорбират хомоложни анти-

тела. Такива адсорбирани моноспецифични антисеруми съдържат антитела срещу различни детерминанти на антигенната молекула, които са хетерогенни по клас (подклас)

Реакцията е разработена от J. Bordet и O. Zhangou през 1901 г. Те установяват, че когато се образува комплекс антиген-антитяло, той свързва комплемента.

Полученото съединение е фино диспергирано и не може да се открие визуално. За да открият адсорбцията (свързването) на комплемента, авторите използват хемолитична индикаторна система: овчи еритроцити и хемолитичен серум. Ако в тестовата система антигенът не съвпада с антитялото, имунният комплекс не се образува и комплементът остава свободен. Комплементът се адсорбира само върху комплекса антиген-антитяло; той не се адсорбира отделно върху антигена или антитялото. Следователно, когато към тестовата система се добави хемолитична система, състояща се от готов комплекс антиген-антитяло (овчи червени кръвни клетки и антитела към тях), комплементът се прикрепя към този комплекс, причинявайки хемолиза на овчи червени кръвни клетки - видим резултат .

Реакцията на свързване на комплемента (CFR) е силно чувствителна и специфична. RSC се използва при серодиагностика на гонорея, сифилис, магарешка кашлица, всички рикетсиози и много вирусни заболявания. Подобно на други серологични реакции, RSC може да се използва и за серотипиране.

RSC е сложна серологична реакция. В него участват две антигенни системи – антитяло и комплемент.

За да настроите RSC трябва:

Сложността на реакцията се определя от броя на участващите съставки и най-вече от необходимостта да се определят техните точни количествени съотношения. Следователно основният експеримент се предшества от титруване на неговите съставки.

Хемолитичният серум се приготвя при производствени условия чрез 3-4-кратна интравенозна имунизация на заек с 50% суспензия от овчи еритроцити и инактивиран при 56 °C за 30 минути. За титрирането му се вземат последователно намаляващи дози (1:1200, 1:1500, 1:1800, 1:2000, 1:2500), 3% суспензия от червени кръвни клетки, комплемент 1:10 в равни обеми (но 0,5 ml). ). Етикетът на ампулите с хемолитичен серум показва неговия титър - максималното разреждане, което осигурява пълен лизис на 3% суспензия от овчи еритроцити в присъствието на комплемент за един час при 37 ° C. За RSC се използва серумно разреждане, увеличено 3 пъти спрямо титъра.

3% суспензия от овчи еритроцити се получава от дефибринирана овча кръв чрез промиване с изотоничен разтвор на NaCl.

Комплементът - пресен или изсушен кръвен серум от морско свинче - се титрира преди експеримента: последователно намаляващи дози (1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40) + хемолитик система (овчи еритроцити и хемолитичен серум). След инкубация в термостат при 37°C се определя титърът на комплемента - най-високото разреждане, което причинява пълно лизиране на червените кръвни клетки в присъствието на хемолитичен серум. Работната доза на комплемента трябва да бъде с 25% по-висока от титъра, т.к активността на комплемента в експеримента може да бъде до известна степен потисната от други реакционни комплементи (антиген, серум).

Антигенът - суспензия от убити микроорганизми, техните лизати, пълни антигени, хаптени, тъканни липидни екстракти - понякога свързва комплемента дори при липса на имунен серум, така че също трябва да се титрира. Приемат се последователно намаляващи дози антиген + работна доза комплемент + хемолитична система. Титърът на антигена е неговата най-малка доза, при която настъпва ясна хемолиза. За RSC се взема доза антиген, която се намалява наполовина спрямо титъра, за да се избегне фиксирането на комплемента.

Преди експеримента тест серумът се инактивира при 56°C за 30 минути. Да инактивира собствения си комплемент.

Всички компоненти на реакцията на свързване на комплемента се вземат в равни обеми.

Настройка на основния експеримент.

След установяване на титъра и работните дози на всички съставки се провежда основният опит на РСК. В реакцията участват и титрувани серуми: тези, за които е известно, че са здрави, и тези, за които е известно, че са болни (съответно отрицателни и положителни серуми). Подобно на тестовия серум, контролният серум също се инактивира при 56°C за 30 минути.

RSC се провежда в две фази:

Фаза I - специфична - инкубиране на смес от антиген, антитяло и комплемент в термостат при 37°C за 30 минути.

II фаза - индикаторна - определяне наличието на свободен комплемент в сместа чрез добавяне на хемолитична система (предварително поставена в термостат за 30 минути) и инкубиране в термостат при 37°С за 20 -30 минути.

Резултатите от експеримента се оценяват, като се отбелязва наличието или отсъствието на хемолиза във всички епруветки (виж таблицата). Реакцията се счита за положителна, когато хемолизата е напълно забавена, когато течността в епруветката е безцветна и червените кръвни клетки се утаяват на дъното, отрицателна, когато течността е интензивно оцветена („лакирана кръв“). Степента на интензивност на хемолизата се оценява в зависимост от интензивността на цвета на течността и размера на утайката на червените кръвни клетки на дъното (+ + + +, + + +, + +, +).

Отчитане на резултатите от RSK.

Резултатите от експеримента (тестов серум) могат да се вземат предвид само ако всички контроли са извършени правилно.

В епруветка № 2 с положителен серум (съдържащ антитела към този антиген) не трябва да има хемолиза, т.к. комплементът се свързва в първата специфична система, а хемолитичната система остава без комплемент - червените кръвни клетки се утаяват на дъното, супернатантната течност е прозрачна.

В епруветка № 3 с отрицателен серум, серумът на здрав човек, който не съдържа антитела към даден антиген, трябва да има хемолиза, тъй като в първата фаза на реакцията не се образува комплекс антиген-антитяло (поради липсата на антитела към този антиген) и комплементът остава свободен. Когато хемосистемата беше добавена във фаза II на реакцията, комплементът беше адсорбиран върху готовия имунен комплекс от овчи червени кръвни клетки плюс антитела към тях; настъпи лизиране на овчи червени кръвни клетки (хемолиза).

Наличието на хемолиза в серумните и антигенните контроли (епруветки № 4 и 5) показва, че техните дози са избрани правилно и че нито серумът, нито самият антиген свързват комплемента. Комплементът, който остава свободен в специфичната система, се адсорбира от имунния комплекс на хемолитичната система и настъпва хемолиза.

Хемолизата в контрола на комплемента (епруветка № 6) показва активността на комплемента и правилния избор на неговата работна доза.

При контрола на хемолитичната система (епруветка № 7), ако тази система функционира правилно, не трябва да има дори следи от хемолиза, т.к. липсва му допълнение.

Ако контролните резултати са перфектни, опитът може да се вземе предвид (епруветка № 1). Отсъствието на хемолиза се счита за положителен резултат. Това показва, че в тестовия серум са открити антитела към даден антиген (човекът е болен). Когато антиген съвпада с антитяло, се образува комплекс антиген-антитяло, който свързва комплемента (фаза I). При добавяне на хемолитична система няма да има хемолиза на червените кръвни клетки във фаза II. Наличието на хемолиза е отрицателен резултат, което показва липсата на антитела към този антиген (човекът е здрав). Комплементът остава свободен и при добавяне на хемолитична система се присъединява към комплекса еритроцит-хемолизин, причинявайки хемолиза.

INРеакцията се основава на две явления - бактериолиза и хемолиза. В тяхното проявление участва комплементът. Следователно в RSC се използват две системи от компоненти: 1) осигурява феномена на бактериолиза и се използва за диагностични цели; 2) хемолитичен, индикаторен, спомагателен; ви позволява да определите дали комплементът е свързан или не е свързан в първата система (вижте цветовата схема, фиг. I). Преди това суспензия от бактерии се използва като антиген, така че първата система се нарича бактериолитична (в положителни случаи настъпва лизис на бактерии).

Създаването на RSC се извършва на два етапа. На първия етап се приготвя бактериолитична система: 0,5 ml тестов серум с антиген се смесват в епруветки, добавя се комплемент в строго определена доза (титър). Сместа антиген-серум-комплемент (бактериолитична система) се държи на водна баня (или термостат) за 20...40 минути при 37...38 "С. Резултатът от взаимодействието на компонентите в епруветката е невидим, течността остава прозрачна и безцветна За да се определи, контакт Ако комплементът е в бактериолитичната система, се провежда вторият етап на реакцията: към епруветките се добавят компоненти на хемолитичната система - промити овчи еритроцити и инактивиран хемолитичен серум , както е показано на схемата.Всички компоненти на бактериолитичната система се разклащат за смесване в епруветката, поставена на водна баня при 37...38"С за 20...40 мин. След това се добавят компонентите на хемологичната система, всичко се разклаща отново и отново се поставя на водна баня за 10...15 минути.

Предварително отчитане на резултата. Ако серумът е получен от болно животно, тогава той съдържа антитела, които се комбинират със специфичен антиген. Към този комплекс (антиген - антитяло) се свързва комплементът - не настъпва хемолиза, резултатът е положителен.

В серума на здраво животно няма антитела: комплексът антиген-антитяло не се образува, комплементът не е свързан в бактериологичната система. Когато се добавят еритроцити и хемолизин (това е между антиген и антитяло), комплементът реагира с този комплекс - настъпва хемолиза, резултатът е отрицателен (вижте цветната фиг. II).

Окончателно отчитане на резултата. Епруветките се оставят на стайна температура за 15...20 ч. Ако серумът в бактериолитичната система е от болно животно, в епруветката се образува специфичен комплекс антиген-антитяло, който адсорбира (свързва) всички добавени допълнение. Следователно, във втората, хемолитична система, няма да настъпи хемолиза, червените кръвни клетки ще се утаят на дъното на епруветката и супернатантната течност ще бъде бистра. Резултатът от RSC е положителен.

Ако тестовият серум не съдържа специфични антитела към използвания антиген (в случаите, когато серумът е от здраво животно), комплексът антиген-антитяло не се образува в бактериолитичната система и следователно комплементът не се адсорбира в тази система, но остава свободен. При добавяне на компоненти на хемолитичната система (във втората фаза на реакцията) комплементът взаимодейства с втория комплекс (хемолизин - червени кръвни клетки), настъпва хемолиза на червените кръвни клетки - не се образува утайка, течността в епруветката е лак-червен на цвят. Резултатът от RSC е отрицателен.

RSK. използвани: 1) за откриване на специфични антитела в серума на болно животно (за диагностика на бруцелоза, перипневмония, сап, лептоспироза, трипанозомоза и др.); 2) за идентифициране на специфичен антиген (бактериален или вирусен) в тестовия материал в присъствието на специфичен имунен серум.

За извършване на RSC е необходимо да имате: получени серумни проби за изследване; два серума, за които е известно, че са положителни (стандартни, даващи положителен резултат) и два нормални серума. Всички серуми, разредени 1:10, се инактивират при 56...58 °C за 30 минути; антиген, разреден според титъра; комплемент, разреден в съответствие с установения титър по време на титруване в бактериолитична система; хемолизин в работен титър; овчи червени кръвни клетки (I: 40); физиологичен разтвор, градуирани пипети, епруветки, стелажи, водна баня при 37...38 °C.

Преди да се извърши RSC, овчата кръв се дефибринира, червените кръвни клетки се промиват с физиологичен разтвор чрез центрофугиране, докато супернатантата стане напълно прозрачна, която се отстранява чрез изсмукване, и утаените червени кръвни клетки се разреждат във физиологичен разтвор 1:40 (2,5%) . Антигенът се разрежда според титъра, посочен на етикета от биофабриката. Хемолизинът и комплементът се титруват преди поставянето на RSC.

Антигенът за RSC се приготвя в биофабрики. Обикновено това са екстракти от унищожени микробни суспензии (или тъкан, съдържаща вирус). Антигените не трябва да имат хемолизиращ ефект, който се контролира по време на реакционния процес (1...2 дози антиген и 0,5 ml суспензия на червените кръвни клетки се изсипват в епруветка: не трябва да има хемолиза). На ампулата с антигена биофабриката показва, че е предназначен за RSC (сапная, бруцелоза или др.). Опаковъчната кутия показва номера на партидата, датата на производство, срока на годност, активността на антигена, т.е. в какво разреждане трябва да се използва при извършване на RSC (1: 100, 1: 150 и др.). При някои заболявания други материали служат като антигени; например, за диагностициране на перипневмония при говеда, антигенът за CSC е лимфата на теле, експериментално заразено подкожно или интраплеврално. При дългосрочно съхранение на антигени титърът им се проверява отново в лабораторията по специална схема на титруване.

Тестовите серуми, получени за изследване, се разреждат с физиологичен разтвор 1: 5 или 1: 10, инактивират се чрез нагряване във водна баня за унищожаване на собствения им комплемент в продължение на 30 минути при 56...58 ° C (серуми на магарета, мулета, калета - при 61 °C).

Хемолизинът се приготвя в биофабрики чрез хиперимунизиране на зайци с измити овчи червени кръвни клетки. За тази цел зайците се инжектират интравенозно с 40...50% суспензия от червени кръвни клетки 4...5 пъти на интервали от 2...3 дни. Седмица след последната инжекция се взема кръв от зайците, серумът се аспирира стерилно, инактивира се, консервира се с глицерол 1:1 или 0,5% фенол, титрира се и се налива в ампули. В лабораториите, преди стадиране, RSC се титрува отново.

Схема за титруване на хемолизин.Необходимо е да се подготви: i) разреждане на комплемента 1: 20; 2) хемолизин 1:100 (0,2 ml хемолизин + 9,8 ml физиологичен разтвор); 3) суспензия от овчи еритроцити 1:40; 4) физиологичен разтвор на NaCl.

За провеждане на реакция на титруване в стойка се поставят два реда епруветки - едната спомагателна само за приготвяне на разреждания на хемолизина, а втората за самото титруване. Първоначално разреждане на хемолизин от 1:100 се добавя към първата епруветка на всеки ред и след това се правят серийни разреждания. Всички епруветки се разклащат и се поставят на водна баня при 37...38°С за 10...15 минути. Отчитане на резултата: в този пример най-малкото количество (или най-високото му разреждане), което е дало пълна хемолиза, е 1: 2000, т.е. това е действителният му титър. Работният титър е 2 пъти по-концентриран - 1:1000.

0,5 ml (означени със стрелки) от всяко разреждане от епруветките от първия ред се прехвърлят в отделни епруветки от втория ред. Добавете 0,5 ml комплемент (1:20), 0,5 ml овчи червени кръвни клетки (2,5% суспензия или 1:40) и 1 ml физиологичен разтвор към всички епруветки от втория ред, така че обемът на течността в всяка епруветка беше 2,5 ml.

Забележка. Въз основа на факта, че крайната формула на RSC ще включва 5 компонента от по 0,5 ml всеки, което ще достигне обем от 2,5 ml, този обем се поддържа през цялата работа.

Епруветките се разклащат и се поставят на водна баня за 10...15 минути. Хемолизата ще настъпи предимно в епруветки с високо съдържание на хемолизин (най-ниското му разреждане е 1: 500, 1: 1000...). Най-малкото количество хемолизин (най-голямото му разреждане), което причинява пълна хемолиза на червените кръвни клетки при дадени условия, се нарича граничен (действителен) титърхемолизин. За по-нататъшна работа хемолизинът се използва 2 пъти по-концентриран, т.е. в двойно количество, двоен титър, който се нарича работно заглавие.Например, ако действителният титър е I: 2500 (или 1: 2000), тогава работният титър съответства на разреждане от 1: 1250 (или 1: W00).

Комплементът е компонент на пресен серум, лимфа, тъканни течности на различни видове животни (и хора); открит от Бюхнер (1889). При насекомите няма комплемент. Комплементът е протеинова субстанция със сложна структура, която бързо се инактивира при нагряване, дългосрочно съхранение, излагане на ултравиолетова радиация, силно разклащане, филтриране през керамични филтри, добавяне на каолин, киселини, основи, алкохол, ацетон, хлороформ, дестилирана вода, суспендирани бактерии и др. Комплементът може да се запази чрез добавяне на 5 g натриев сулфат и 4 g борна киселина на 100 ml серум от морско свинче. Активността на комплемента продължава до шест месеца. Най-добрият начин за консервиране е сушенето под вакуум при ниски температури (лиофилизация). В запечатани ампули в това състояние издържа две години. Преди всяка процедура на RSC активността на комплемента се проверява чрез титруване, т.е. определя се неговият титър - оптималното количество, необходимо за дадена реакция. Комплементът се титрира два пъти: в хемолитична и бактериолитична система.

За титриране на комплемента в хемолитичната системапригответе компонентите: комплемент в разреждане 1:20 (1 ml комплемент + 19 ml физиологичен разтвор); хемолизин, разреден според работния титър; суспензия от промити овчи еритроцити (1:40), физиологичен разтвор. Епруветките се поставят в поставка и в тях с градуирана пипета се наливат различни количества комплемент на интервали от 0,03 ml (0,13; 0,16; 0,19; 0,22..: до 0,43 ml). След това добавете останалите компоненти (фиг. 57). Всички епруветки се разклащат и се поставят на водна баня при 37...38 °C за 10...15 минути и резултатът се записва.

Отчитане на резултата: като титър на комплемента се приема най-малкото количество комплемент, което осигурява пълна хемолиза (в този пример - 0,25 ml).

Резултатът от титруването започва да се взема предвид в епруветки с най-високо съдържание на комплемент, където основно се очаква хемолиза. Най-малкото количество комплемент, което осигурява пълна хемолиза на червените кръвни клетки при определени условия, се нарича титър на комплемента в хемолитичната система.

За титруване на комплемента в бактериолитичната системанеобходимо е да има всички компоненти на реакцията: комплемент (1:20), червени кръвни клетки (1:40), хемолизин в работния титър, два положителни и два нормални серума, специфичен антиген. Серумите се разреждат с физиологичен разтвор 1:10, инактивират се за 30 минути при 56...58 X. Всеки серум се излива в два реда епруветки от 0,5 ml. Към епруветките на всеки ред се добавя комплемент в нарастващи количества, както при титруване в хемолитична система; започва се с количеството, взето за титъра в хемолитичната система, след което във всяка следваща епруветка дозата се увеличава с 0,03 ml, като обемът се изравнява до 0,5 ml с физиологичен разтвор.

След това към един ред епруветки с положителни и нормални серуми се добавят 0,5 ml антиген, а към втория ред от всеки серум се добавят 0,5 ml физиологичен разтвор. Всички епруветки се разклащат и се поставят на водна баня за 30...40 минути. След това във всички епруветки се добавят 0,5 ml хемолизин и 0,5 ml еритроцити, разклащат се и отново се поставят на водна баня за 10...15 минути. Най-малкото количество комплемент, което осигурява пълен лизис на червени кръвни клетки в двата реда епруветки (с антиген и без антиген) на два нормални серума, в един ред (без антиген) на всеки положителен серум и с пълно забавяне (липса) на хемолиза в редици положителни серуми с антиген (в същите тези дози комплемент), т.нар титър на комплемента,който се използва при създаването на основния опит на RSC в диагностичните изследвания.

Основният опит на RSC (самите диагностични изследвания). Два реда епруветки се поставят в стелажи според броя на изследваните серумни проби. 0,5 ml от всеки инактивиран серум се налива в две епруветки: в едната се добавя антиген - 0,5 ml, в другата (без антиген) 0,5 ml физиологичен разтвор и с добавяне на комплемент се прави бактериолитична система, а след това - хемолитична. добавен.

Необходими компоненти: 1) тест серум, инактивиран, разреден с физиологичен разтвор 1: 10; 2) специфичен антиген, разреден според титъра, посочен от биофабриката върху етикета на опаковката; 3) комплемент в установения титър; 4) хемолизин в работния титър; 5) суспензия от промити овчи еритроцити 1: 40; 6) физиологичен разтвор на NaCl. Тестовите серуми се изсипват в два реда епруветки. За произволен брой тестови серуми като контрола се използват известен положителен серум (даващ положителен резултат) и нормален (от здраво животно, даващ отрицателен резултат).

Епруветките с компонентите на бактериолитичната система се разклащат и се поставят на водна баня за 20...40 минути при 37...38°С. Епруветките от втория ред бактериолитична система без антиген се разклащат и се поставят на водна баня при същите условия.

След това компонентите на хемолитичната система се добавят към всички епруветки от първия и втория ред и се поставят втори път на водна баня за 10..15 минути. Във всички тръби от втория ред без антиген настъпва пълна хемолиза.

Преди получаване на крайния резултат епруветките се оставят на стайна температура за 18...24 ч. Във всички епруветки без антиген, независимо от това дали серумът е получен от болно или здраво животно, трябва да настъпи хемолиза, в първата ред епруветки с антиген, по-ясен резултат се изразява при изправяне.

Отчитанията на реакцията в епруветки с тестови серуми се считат за надеждни, ако няма хемолиза в епруветки с положителни серуми и антиген, с пълна хемолиза в епруветки с положителен серум без антиген и във всички епруветки с очевидно нормален серум (фиг. 61). ).

Тази реакция трябва да бъде придружена от контроли на антиген, комплемент, хемолизин и еритроцити. За да направите това, антигенът с овчи червени кръвни клетки се излива в отделни епруветки; комплемент с червени кръвни клетки без хемолизин; хемолизин с червени кръвни клетки без комплемент; червени кръвни клетки и физиологичен разтвор. Обемът във всяка епруветка се регулира до 2,5 ml с физиологичен разтвор. Епруветките се разклащат и се поставят на водна баня при 37 °C за 20 минути. Не трябва да има хемолиза във всички контролни епруветки.

RSK резултатОбичайно е да се изразява в „кръстове“. Индикатори за положителен резултат от реакцията: + + + + (///) - пълно утаяване на червените кръвни клетки (без хемолиза), течността над утайката е безцветна, + + + (///) - течността над утайката е едва забележимо жълтеникава. Съмнителен резултат от реакцията: наличието на утаени на дъното еритроцити и частично оцветяване на супернатантата поради лизиране на някои от еритроцитите се обозначава + + - (++), тоест два и два и половина кръста . Тежка хемолиза (без утайка) или с малка утайка (+) е отрицателен резултат.

Дългосрочна реакция на свързване на комплемента (LDCR).По-ефективен в чувствителността за разлика от обичайния класически RSK. Същността на реакцията е, че бактериолитичната система се поддържа при три различни температурни условия: след смесване на компонентите при стайна температура за 15 минути, след това при ниска температура (4 ° C) в хладилник за 18...20 часа и в водна баня за 15 минути. След това се добавя хемолитичната система, разклаща се, поставя се отново на водна баня и реакцията се записва, както при RSC. Ефективността на RDSC е потвърдена при диагностицирането на редица инфекциозни заболявания (туберкулоза, вибриоза, бруцелоза и др.).

Реакция на потискане на фиксирането на комплемента (CPF) или реакция на инхибиране, индиректна FCC.Друг компонент участва в тази реакция - стандартен имунен серум, съдържащ антитела срещу антигена, който обикновено се използва за диагностика и следователно реагира положително при класически CSC.

Тестовият серум се смесва с антигена и се оставя известно време без комплемент. След това се добавят комплемент и стандартен серум, епруветките се разклащат и се поставят на водна баня за 20...30 минути, след което се добавя хемолитичната система и се поставя отново във водна баня. Ако няма хемолиза, резултатът е отрицателен, тъй като тест-серумът не реагира с антигена, а последният реагира със стандартния серум, фиксиращ комплемента. Ако тестовият серум е от болно животно, той съдържа специфични антитела по отношение на антигена, т.е. възниква реакция между антигена и антителата без фиксиране на комплемента. Антигенът, взаимодействайки с антителата на тестовия серум, не реагира (потиска) със стандартния (известен специфичен) серум, комплементът остава свободен и реагира в хемолитичната система - настъпва хемолиза, резултатът от реакцията е положителен по отношение на към тестовия серум.

Метод флуоресцентни антитела (MFA).Възможностите на този метод се дължат на спецификата на първата фаза на серологичните реакции с високата чувствителност на луминесцентния анализ. За извършване на MFA е необходимо да има високоспецифични имунни луминесцентни серуми. Известно е, че в различни серологични реакции, използвани в микробиологичната практика, участват главно три компонента: бактериален антиген, антитяло и комплемент. И трите компонента всъщност са антигени и срещу всеки от тях могат да се получат имунни серуми и съответно луминесцентни антитела. В зависимост от вида на използвания флуоресцентен серум (срещу бактериален антиген, антибактериални антитела, комплемент), има три основни варианта на метода с флуоресцентни антитела: директен (1) и индиректен (2) вариант и модификация на индиректния вариант с използване на комплемент. Имунологичната реакция между антиген и антитяло се извършва в тези модификации директно върху предметното стъкло. За фиксиране на микроорганизми се използват органични разтворители: ацетон, етанол, метанол, диоксан, както и конвенционални фиксатори, използвани в микробиологичната практика: формалин, смес на Никифоров, течност на Карнуа и др.

Директен вариант. Върху готовия препарат се нанася специфичен луминесцентен серум за определено време, след което излишният серум се отцежда, препаратът се измива и се гледа под луминисцентен микроскоп. Този метод се използва за откриване на бактерии в патологичен материал, обекти на околната среда, както и за идентифициране на патогени в култури.

Индиректна (двустепенна) опция. На първия етап се получава специфична комбинация от антигена със съответното антитяло от небелязан серум. Във втория етап специфично небелязано антитяло се свързва с анти-видово луминесцентно антитяло, съдържащо се в серума на животно, имунизирано с глобулини (или цял кръвен серум) от вида, от който е използван имунният серум.

Непряка антикомплементарна (тристепенна) опция. Първи етап: образуване на комплекс антиген-небелязано антитяло. Втори етап: наслояване на нормален серум, съдържащ комплемент. Третият етап: комплексът антиген-антитяло-комплемент се третира с луминисцентен анти-комплементарен серум, получен чрез имунизиране на зайци със серума на животинския вид, който служи като източник на комплемент.

Индиректните варианти на MFA могат да се използват както за откриване на антигени, така и за откриване на антитела. Освен това, за да настроите двустепенна опция, трябва да имате ограничен набор от антивидови луминесцентни серуми (срещу говежди, овнешки, конски, свински и др. глобулини), а за антикомплементарната опция е достатъчно, за да има само един луминисцентен серум срещу глобулини от морско свинче.

Методи на имунолуминесценция и микроскопия. В практиката на ветеринарните бактериологични лаборатории се използват биофабрикирани луминесцентни серуми. В зависимост от вида на флуорохрома, луминесцентните серуми осигуряват или зелено сияние на обекта (багрило на базата на флуоресцентна светлина), или червено сияние (багрило на базата на родамин).

За извършване на имунолуминесцентна микроскопия, материалът за изследване трябва да се нанесе върху обезмаслено, тънко и без надраскване предметно стъкло. При изследване на животински органи и тъкани препаратите за пръстови отпечатъци се приготвят на тънък слой. Препаратите се сушат на въздух и се поставят във фиксираща течност (етанол - 15 минути, метанол - 5 минути, ацетон - 5 минути). Ако е необходимо, след фиксиране, препаратите могат да се съхраняват в хладилник за известно време. Последователността и по-нататъшните процедури зависят от използваната версия на MFA (едностепенна, двустепенна, тристепенна). Третирането на препарати с луминесцентни серуми, както и немаркирани серуми от първи етап и комплемент, се извършва при 37°C във влажна камера (панички на Петри с навлажнена филтърна хартия).

Едноетапен вариант.Луминесцентният серум се нанася върху предметно стъкло с фиксиран тестов материал (в разреждането, посочено на ампулата). Лекарството се поставя във влажна камера за 15...20 минути при 37 ° С. След това се промива с буфериран физиологичен разтвор (pH 7,4) в съд, като разтворът се сменя няколко пъти след 5...10 минути, или под течаща чешмяна вода за 3...5 мин. Водата трябва да е неутрална и без желязо.След това препаратът (може да има няколко петна върху едно стъкло) се изсушава на въздух или с филтърна хартия, след което капка буфериран глицерол с pH 8,0 се прилага и се покрива с покривно стъкло. Нефлуоресцентна течност за потапяне се нанася върху покривно стъкло и се изследва под микроскоп.

Двустепенен вариант.Капка от първи етап, небелязан имунен серум се нанася върху предметно стъкло с тестовия материал. Лекарството се поставя в термостат във влажна камера за 15...20 минути. След това се измива, както е описано по-горе, изсушава се и се нанася капка луминисцентен антивидов серум. Лекарството отново се поставя в термостат във влажна камера за 15...20 минути. Повторете процедурата по измиване и изсушете с филтърна хартия. Прилага се буфериран глицерол, покрива се с покривно стъкло, прилага се нефлуоресцентна течност за потапяне и се изследва под микроскоп.

Тристепенна опция (антикомплементарна).Капка от първи етап, небелязан имунен серум се нанася върху предметно стъкло с тестовия материал. Лекарството се поставя в термостат, както е описано по-горе, изсушава се и върху намазката се нанася капка комплемент. Лекарството отново се поставя във влажна камера и в термостат за 15...20 минути, след което се измива и се нанася луминисцентен антикомплементарен серум. Последващите процедури са подобни на опцията с една стъпка.

Приготвяне и обработка на контролни препарати. 1. За директния вариант, за да се определи специфичността на реакцията между антигена и луминесцентния серум, препаратите за намазка от хетероложни микробни видове трябва да се третират със същия серум. Тези видове трябва да бъдат антигенно подобни, но различни по морфология от изследваните микроорганизми; антигенно отдалечени от изследваните микроорганизми, но сходни по морфология и разпространение с тях. Препаратите за отпечатъци се третират с луминисцентен нормален серум.

2. За индиректния вариант е необходимо да има три контролни препарата, третирани с нормален серум, луминесцентен антивидов серум без имунен небелязан серум и луминисцентен антивидов серум с известен имунен серум от първия етап.

3. За индиректния вариант с допълнениенеобходими са контролни препарати, при лечението на които имунният серум се заменя с нормален серум от същия тип и в същите разреждания, както и препарати, третирани с всички съставки с изключение на имунния серум.

Оценка на резултатите. Вземат се предвид яркостта, цвета, локализацията и структурата на сиянието. Бактериите, оцветени с луминисцентен серум, белязан с флуоресцеин изотиоцианат, имат ярко зелено сияние по периферията под формата на ръб или ореол, централната част свети слабо. Това сияние се нарича специфично, за разлика от неспецифично, когато цялото тяло на клетката свети равномерно. Колкото по-изпъкнала е бактериалната клетка в препарата, толкова по-остър е ръбът. Това сияние може да се обясни с факта, че от единица площ на "периферията" на клетката се проектират няколко пъти повече антитела върху ретината на окото на наблюдателя, отколкото от централната част на микробната клетка. Трябва да се има предвид, че пластмасовите клетки (лептоспири, вибриони) нямат контур или той е слабо забележим. При клетки, потопени в тъканна течност и при млади антраксни бацили, очертанията обикновено са замъглени.

Интензитетът на луминесценцията се оценява с помощта на системата с четири кръста: + + + + - много ярка флуоресценция по периферията на микробната клетка, ясно контрастираща с тъмното тяло на клетката; + + + - ярка флуоресценция на клетъчната периферия; + + - слаб блясък на клетъчната периферия; + - без контрастен блясък на периферията на тялото на микробната клетка. Липсата на специфичен блясък се обозначава с "-" (виждат се сенки на микроорганизми). При диагностицирането на различни патогени най-често положителен резултат се счита за специфично сияние на бактериални клетки от най-малко четири или три кръста.